“变色龙”式的AIE荧光探针用于脂滴-溶酶体相互作用的可视化研究
研究内容简介 细胞内的细胞器并不是独立存在的，而是相互之间有着物质传递和信息交流，例如脂滴和溶酶体之间的相互作用在细胞代谢过程中发挥了重要的作用。脂滴中的成分能够被溶酶体降解，称为“脂噬”，是“自噬”的一种。有研究证明脂滴与溶酶体之间的相互作用与很多炎症及相关代谢疾病有着莫大的关系。虽然已经有报道利用荧光蛋白研究脂滴-溶酶体之间的相互作用，但是存在操作复杂等问题，利用性能优良的荧光纳米探针做相关研究的报道很少。华南理工大学唐本忠院士团队赵祖金教授课题组设计了一种对细胞内极性敏感的新型红光聚集诱导发光（AIE）分子，并制备了具有高的光稳定性及良好生物兼容性的荧光纳米探针。研究表明该探针在高极性的溶酶体和低极性的脂滴中分别呈现红光和蓝光发射，通过监测荧光信号的变化，发现该探针可以通过内吞途径进入溶酶体，接着逃逸到脂滴，最后又回到溶酶体的代谢过程，并且能够清楚观察到酯滴的分裂过程，为研究脂滴-溶酶体相互作用甚至相关疾病的机理提供了一种新思路。
图1 TPA-BTTDO NPs进入细胞及在细胞内代谢的示意图。
该新型红光AIE分子的结构如图1中所示（TPA-BTTDO），主要由吸电子的氧化并二噻吩及给电子的三苯胺组成，其在高极性环境下会存在强的分子内电荷转移（TICT）效应。为了增加该荧光分子在水中的分散性，利用共沉淀法以DSPE-PEG2000 为包覆基质制备了粒径为50 nm左右的纳米探针。通过研究纳米探针在不同pH环境下的粒径及光谱变化，发现该纳米探针具有良好的稳定性。通过细胞成像实验研究不同时间段该纳米探针在细胞内的分布发现（图2），该探针最开始分布在溶酶体中（2 h），并且细胞内吞实验证明探针进入细胞是一个网格蛋白介导的细胞内吞过程。4 h后，该探针逐渐在脂滴中富集，说明此时已从溶酶体中逃逸。随着培养时间的增加，溶酶体中的探针信号不断降低，而脂滴中不断增加，最终达到一个平衡，说明探针能够同时定位在细胞内的溶酶体和脂滴。若用油酸诱导HeLa细胞产生大量脂滴后，探针则全部分布在脂滴中，说明该探针更倾向于富集在脂滴中。
图2 HeLa细胞与 TPA-BTTDO NPs 分别作用 2 (A), 4 (B), 12(C) 和 24 h (D)的CLSM图, 并与脂滴染料BODIPY 和溶酶体染料 Lysotracker共定位。
更有趣的是，通过研究探针在溶酶体和脂滴的发光行为，发现其具有双发射模式，即在溶酶体中发射红光而在脂滴中发射蓝光（图3）。这主要是因为探针分子的D-A结构使其对细胞内极性比较敏感，在高极性的溶酶体和低极性的脂滴中表现出“溶剂化”效应。研究不同极性溶剂中探针的荧光光谱，发现其在高极性溶剂中主要发红色荧光，随着极性降低其发光不断蓝移，进一步地证明极性是影响探针在细胞内发光行为的主要原因。而脂滴中的成分复杂，也是导致探针在脂滴中发射蓝移到498 nm的另一个原因。该探针这种“变色龙”式的行为，能够用于研究脂滴-溶酶体之间的相互作用。
图3 （A）TPA-BTTDO NPs发射蓝色荧光时与BODIPY的共定位分析及（B）在细胞内的光谱。（C）TPA-BTTDO NPs呈红色荧光时与溶酶体染料Lysotracker的共定位情况及（D）在细胞内的光谱。
基于探针在细胞内的“变色”行为，我们通过监测荧光颜色的变化，追踪探针在脂滴中的代谢行为。为了降低来自溶酶体中探针信号的干扰，用油酸诱导HeLa细胞，使探针全部富集在脂滴中。从图4中可以看出，第一天在细胞内可以检测到明亮的蓝色荧光，说明此时探针确实分布在脂滴中。48 h后，红色荧光逐步呈现，并且随着时间的推移，红色荧光明显增加，96 h后细胞内几乎检测不到蓝色荧光，全部转变成红色荧光。分别通过与线粒体染料Mitotracker和溶酶体染料Lysotracker共定位分析发现，红色荧光分布在溶酶体中，说明通过溶酶体逃逸富集在脂滴中的探针最后通过脂滴代谢再次回到了溶酶体中。
图4 TPA-BTTDO NPs在细胞内的代谢过程。(A) HeLa细胞与TPA-BTTDO NPs 作用后四天内细胞内荧光颜色的变化。HeLa细胞与TPA-BTTDO NPs作用后第四天分别与(B) 溶酶体染料Lysotracker及(C) 线粒体染料Mitotracker共定位情况。
以上结果表明该类基于新型红色AIE分子制备的荧光纳米探针具有特殊的发光行为，利用其在细胞内不同极性环境中的“变色”现象，高灵敏地示踪了细胞内脂滴-溶酶体相互作用，为研究相关生理过程及疾病机制提供了一种新思路。
论文第一作者为华南理工大学博士后胡蓉和博士生陈斌，华南理工大学赵祖金教授，中国地质大学娄筱叮教授和香港科技大学唐本忠教授为该文章的共同通讯作者。
赵祖金：教授，博导。入选第四批国家“万人计划”青年拔尖人才，广东省自然科学杰出青年基金获得者。英国皇家化学会会士。2018年入选高被引科学家。2003年毕业于浙江大学化学系，获理学学士学位。2008年获浙江大学化学博士学位。2008年至2010年在香港科技大学进行博士后研究，师从中国科学院院士唐本忠教授。2013年9月进入华南理工大学材料科学与工程学院，发光材料与器件国家重点实验室工作。主要研究领域为有机光电功能材料，聚集诱导发光，OLED器件，单分子导线和生物探针等。已公开发表SCI收录的学术论文200余篇，论文他引5400余次，h-指数为44。获授权中国发明专利15项。
娄筱叮：教授，博导。国家优秀青年科学基金获得者，湖北省“楚天学者计划”楚天学子，湖北省青联十三届委员会常委，湖北省第十二次妇女代表，湖北省青年科学协会委员，中国生物材料学会影像材料与技术分会第一届委员。2012年在武汉大学获得理学博士学位（导师：李振教授），同年加入香港科技大学进行博士后研究，师从中国科学院院士唐本忠教授。2013-2016年，华中科技大学化学与化工学院讲师、副教授（期间2016.04-2016.10作为访问学者，在加州大学圣塔芭芭拉分校物理系交流，合作导师为Alan J. Heeger 教授）。2017年至今，中国地质大学（武汉）材料与化学学院教授、博导。目前研究兴趣集中在有机光电材料在化学生物传感器中的应用方面。在国际核心期刊上发表/接收SCI论文91篇（影响因子大于5的论文62篇, 影响因子大于10的论文11篇, 高被引论文5篇）。相关研究成果已被国际知名刊物引用2300余次H因子为27。参与主持编写英文著作“Biosensors based on sandwich assays”一部（Springer出版社）。授权专利6项。
唐本忠：教授，中国科学院院士，1982年于华南理工大学获学士学位，1985年、1988年先后获日本京都大学硕士、博士学位，曾在多伦多大学从事博士后研究工作，1994年加盟香港科技大学，2012年受邀在华南理工大学组建研究团队；其主要从事高分子化学和光电功能材料研究，在聚集诱导发光（Aggregation-Induced Emission, AIE）这一化学和材料前沿领域取得了原创性和引领性的研究成果。现任国家自然科学基金基础科学研究中心项目负责人、广东省引进创新科研团队带头人、华南理工大学发光材料与器件国家重点实验室学术委员会主任，以及中国化学会和英国皇家化学会联合期刊Materials Chemistry Frontiers主编等；已累计发表学术论文约1100余篇，引用60000余次，h-指数为128，并于2014-2018年连续多次入选化学和材料双领域高被引用科学家。
该研究得到了国家自然科学基金（21788102 和 21673082）和广东省自然科学基金（2016A030312002）等的支持。
论文信息
Paper information
Rong Hu#, Bin Chen#, Zhiming Wang, Anjun Qin, Zujin Zhao*, Xiaoding Lou*, Ben Zhong Tang*. Intriguing “chameleon”fluorescent bioprobes for the visualization of lipid droplet-lysosome interplay. Biomaterials 2019, 203: 43-51.